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Inhalt:

Weiterentwicklung eines einzelmolekül-sensitiven Microarray-Scanners zur bildbasierenden Zytometrie

Dipl.-Ing. Dr. Clemens Hesch

Dipl.-Ing. Dr. Clemens Hesch
   

Betreuer und 1. Begutachter:

Univ.-Prof. Dipl.-Ing. Dr. Gerhard Schürz

2. Begutachter:

Univ.-Prof. Dipl.-Ing. Dr. Bernhard Zagar

Rigorosum:

06. Mai 2011

Einzelmolekül-sensitive Fluoreszenz-Mikroskopie ist derzeit eine der meist verwendeten Technologien in biologischer und medizinischer Forschung. Neue Anwendungen auf dem Gebiet der Zytometrie verlangen nach schnellen und zuverlässigen Messmethoden für die Akquisition großer Mengen an (Bild)daten die zur anschließenden statistischen Auswertung benötigt werden. In dieser Arbeit habe ich mich mit zwei besonders störenden Problemen befasst: dem eingeschränkten Zeitbezug beim Scannen in mehreren Farbkanälen und dem Auftreten von Bildunschärfen beim allgemeinen Scannen.
Nach einer einführenden Übersicht über die Technik der Fluoreszenz-Mikroskopie beschreibe ich die Limitierungen, wie sie bei verschiedenen kommerziellen und wissenschaftlichen Biochip-Scannern vorkommen. Eine tiefer gehende Diskussion der relevanten physikalischen und technischen Aspekte führt zum Konzept eines weiterentwickelten Fluoreszenz-Scanners, dessen Implementierungs-Details schließlich beschrieben werden.
Um dem eingeschränkten Zeitbezug im Mehrfarbenscannen zu begegnen wurde ein multi-color alternating excitation System entwickelt. Durch raschen Wechsel zwischen den Anregungswellenlängen, damit synchronisierter Probenbewegung und Datenauslesung können mehrere, in engem Zeitbezug stehende Scan-Bilder in verschiedenen Farbkanälen gewonnen werden. Diese Methode kombiniert Einzelmolekül-Sensitivität mit der scharfen Abbildung von bewegten Objekten (D~0.5µm²/s), wie sie z.B. in Lipid-Bilayern oder lebenden Zellen vorkommen. Eine Lokalisierungs-Genauigkeit für Punktlichtquellen von ca. 10 nm wird ebenfalls gezeigt.
Ein weiteres Problem sind Bild-Unschärfen, wie sie beim schnellen Scannen in Biochip-Anwendungen auftreten. Hier ist ein Verfahren notwendig, das die Probe zuverlässig in der Fokalebene des Objektivs hält. Die hierfür neu entwickelte Methode benutzt den total-reflektierten Anregungslaser als Fehlerindikator. Zusammen mit einer zweistufigen Objektiv-z-Verstellung (stufenweise grob und analog fein) wird ein Regelkreis gebildet, der einen einmal gewählten Objekt-Objektiv-Abstand stabil innerhalb der Schärfentiefe des Systems (typisch einige Hundert Nanometer) hält. Das Verfahren ermöglicht schnelles, einzelmolekül-sensitives Scannen über mehrere cm².
Weiters beschreibt diese Dissertation zwei Anwendungen der obigen Technologien: erstens ermöglichte diese optimierte Messmethode Protein-Protein-Interaktionsstudien in lebenden Zellen auf mikrostrukturierten Oberflächen. Diese waren mit fluoreszenz-markierten Antikörpern funktionalisiert. Nach dem Zellkontakt wurde die Umverteilung der ebenfalls markierten, assoziierten Membranproteine gemessen (die biologischen Ergebnisse dazu finden sich detailliert in der Dissertation von M. Schwarzenbacher).
Zweitens wurde auf dem Setup eine Methode zur Unterscheidung von mobilen Fluorophoren und statischen Emittern (z.B. Schmutzpartikel) implementiert. Im asynchronen time-delay and integration (TDI) Mode wurde der zeitliche Verlauf des Fluoreszenz-Signals aufgezeichnet. In Verbindung mit einer Rotation der Polarisationsebene des Anregungssignals war eine Charakterisierung der Absorptions-Dipole möglich. Es wurde gezeigt, dass damit Proteine mit Labelling von 0.55 bis 2.89 Fluorophoren unterschieden werden können.

Abbildung 1: Alternating excitation scanning von fluoreszenz-markierten Zellen. CHO-Zellen wurden mit EYFP-CD147 transfiziert und mit Alexa 647-Fab gegen CD147 markiert. Die zwei Farbkanäle des Scans (400 µm x 200 µm) sind in a) und c) für 647 nm Anregung und in b) und d) für 514 nm Anregung abgebildet. Die vergrößerten Ausschnitte zeigen deutlich Kolokalisation des EYFP-CD147 und dessen spezifischen Antikörper (zur Verdeutlichung wurde die Colormap in den Ausschnitten geändert).

Abbildung 1: Alternating excitation scanning von fluoreszenz-markierten Zellen. CHO-Zellen wurden mit EYFP-CD147 transfiziert und mit Alexa 647-Fab gegen CD147 markiert. Die zwei Farbkanäle des Scans (400 µm x 200 µm) sind in a) und c) für 647 nm Anregung und in b) und d) für 514 nm Anregung abgebildet. Die vergrößerten Ausschnitte zeigen deutlich Kolokalisation des EYFP-CD147 und dessen spezifischen Antikörper (zur Verdeutlichung wurde die Colormap in den Ausschnitten geändert).