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Entwicklung eines Einzelmolekül-Mikroskopes zur Analyse von biologischen Zellen, DNS und Expressionsprofilen

Dipl.-Phys. Dr. Jan Hesse

Dipl.-Phys. Dr. Jan Hesse
   

Betreuer und 1. Begutachter:

Univ.-Prof. Dr. Peter Hinterdorfer

2. Begutachter:

Univ.-Prof. Dipl.-Ing. Dr. Bernhard Zagar

Rigorosum:

20. Juli 2004

Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein neuartiges Gerät zur Fluoreszenzdetektion von großen Flächen entwickelt. Es wurde speziell entworfen, um Biochips mit hoher Geschwindigkeit und Einzelmolekül-Empfindlichkeit auszulesen. Ein konventionelles Epi-Mikroskop bildet die Grundlage für das Instrument, welches mit einem hoch präzisen xy-Tisch für die Probenpositionierung im 100nm Bereich ausgestattet ist. Die eingesetzten Objektive mit großer numerischer Apertur zeichnen sich durch eine gute Sammeleffizienz aus, stellen aber aufgrund ihrer geringen Fokustiefe hohe Anforderungen an die Fokussierung der Probe. Um Defokussierungen während der Messung zu vermeiden, wurde ein so genanntes Focus Hold System (FHS) implementiert, welches den Abstand zwischen Objektiv und Probenoberfläche konstant hält. Als Steuersignal wird dabei an der Probenoberfläche reflektiertes Laserlicht verwendet. Als Lichtquellen werden Laser verwendet, welche die selektive Anregung der Fluoreszenzfarbstoffe Cyanin3 (Cy3) und Cyanin 5 (Cy5) erlauben. Das Anregungsprofil wird mit Hilfe einer Kombination aus einer asphärischen, einer sphärischen Linse und der Objektivlinse auf die auf dem Detektor abgebildete Fläche beschränkt, um unnötiges Photobleichen zu vermeiden. Zur Fluoreszenzdetektion wird eine hoch sensitive CCD Kamera im "time delayed integration'' (TDI) Modus verwendet. In dieser Betriebsart werden Probenbewegung und das Auslesen der Kamera synchronisiert, wodurch Overhead-Zeiten bei der Signalaufnahme vermieden werden. Proben in einer Größe von 5x5mm2 können mit dem hier vorgestellten Instrument innerhalb von 12 Minuten bei einer Pixel Größe von 200x200nm2 mit Einzelmolekül-Empfindlichkeit ausgelesen werden.

Die korrekte Funktion des Instruments wurde an dem Modellsystem einer Lipid-Doppelmembran getestet. Dabei diente Dipalmitoyl-Phosphatidycholine (DPPC) als nicht fluoreszentes Matrixmaterial für Cy5-markiertes Dipalmitoyl-Phosphatidylethanolamine (DPPE-Cy5). Die in einem molaren Verhältnis von 1:10^8 eingesetzten DPPE-Cy5 Moleküle sind in den Fluoreszenzdaten klar als beugungslimitierte Maxima mit einem Signal/Rausch Verhältnis von ~37 zu erkennen. Die korrekte Synchronisation und Funktion des FHS kann daraus geschlossen werden, daß die Breite der Intensitätsmaxima auf dem gesamten Bild dem Beugungslimit entspricht.

Ein Anwendung des Instruments ist das Screening von lebenden Zellen. Hier wurde die Expression von Ionenkanälen in Jurkat Zellen in vivo untersucht. Diese T-Lymphozyten exprimieren in der Plasmamembran den Kaliumkanal KV1.3. Dieser Ionenkanal wurde mit Hilfe des Cy5 markierten Hongotoxins (HgTX1-A19C-Cy5) spezifisch adressiert. Um alle KV1.3 Kanäle zu markieren, wurden die Zellen unter sättigenden Bedingungen mit dem markierten Toxin inkubiert. Die Anzahl der Ionenkanäle wurde durch Zählen der Einzelmolekül-Signale pro Zelle bestimmt. Eine breite Verteilung von 0 bis 400 Kanälen pro Zelle konnte bestimmt werden.

Die Anwendbarkeit des Systems für die Analyse von Biochips wurde an einer speziell entwickelten Chip Plattform zur Proteindetektion getestet. Zu diesen Zweck wurde ein ``sandwich fluorescent linked immunosorbent assay (sandwich FLISA)'' durchgeführt, bei welchem humanes Interleukin 2 (hIL-2) mit Hilfe immobilisierter spezifischer Antikörper an der Chipoberfläche gebunden wurde. Die Markierung erfolgte durch einen zweiten, Cy3 markierten spezifischen Antikörper. In diesen Experimenten wurde ohne Signalverstärkung ein Detektionslimit von 5pg hIL-2/ml erreicht.

Im letzten Kapitel wird ein Experiment präsentiert, welches optische und elektrische Einzelmolekül-Detektion kombiniert. Dabei wurde die Kanalformierung von Gramicidin untersucht. Mit Hilfe des "Förster resonance energy transfer (FRET)'' wurde die Dimerisierung von Gramicidin Monomeren optisch beobachtet. Gleichzeitig wurde der Strom durch die dabei gebildeten Ionenkanäle elektrisch gemessen. Diese Experimente erlauben erstmals die Korrelation der Funktion von Gramicidin Kanälen mit ihrer Struktur und demonstrieren die Realisierbarkeit der Kombination von optischen und elektrischen Einzelmolekülmessungen.