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Isabella Derler - Ionenströme als Krebsdetektive

Molecular Mechanism of TRP channel regulation

oder

Ionenströme als Krebsdetektive

Isabella Derler
angefertigt am Institut für Biophysik

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Prostatakrebs (Abb. 1) ist sowohl in den USA wie auch in Europa die am häufigsten auftretende Krebsart bei Männern. Da die Wahrscheinlichkeit einer Erkrankung mit zunehmendem Alter steigt, wird aufgrund der immer älter werdenden Bevölkerung mit einem Anstieg an Prostatakrebspatienten gerechnet. Um einen möglichen Therapieansatz zu liefern, müssen die Regulationsmechanismen in diesen Zellen verstanden und die daran beteiligten Proteine bzw. deren Wechselspiel analysiert werden.

Abb 1: A) Gesundes Prostatagewebe B) Prostatakrebsgewebe

Bestimmte Poren in Zellmembranen sind für Ionen durchlässig, sogenannte Ionenkanäle (Abb 2). Durch diese Kanäle, die aus Aminosäuren aufgebaut sind, können Ionen aus der Zelle raus oder auch in die Zelle reinströmen. Der stark Kalzium-durchlässige TRPV6 Kanal 1) kommt nur bei Prostatakrebs und nicht in gesunden Zellen vor (Abb 3).

Dies kann ein Indiz dafür sein, dass dieser Kalziumstrom über TRPV6 Proteine für die Krebsentstehung von Bedeutung ist. Um ein Medikament hierzu zu entwickeln, müssen jedoch vorerst die zellulären Mechanismen verstanden werden, die diesen TRPV6 Kalzium Strom regulieren.

Abb 2: Ionenkanal in der Plasmamembran: bestehen aus Transmembrandomainen und eine Porenregion.

Abb 3: Nachweis, dass TRPV6 in Prostatakrebszellen vorkommt (siehe rotbraune Markierung in rechter Abbildung) im Gegensatz zum gesunden Gewebe (linke Abbildung).

Meine Arbeit untersucht insbesondere die TRPV6-Regulation durch das Kalzium-Bindeprotein Calmodulin (CaM).

Die Patch-Clamp Technik ermöglicht das Messen der kleinen Kalziumströme durch die TRPV6 Ionenkanäle direkt an der lebenden Prostatakrebszelle, indem eine Pipette sehr dicht an die Zellmembran gebracht wird, und eine Verbindung zwischen Zell- und Pipetteninneres geschaffen wird (Abb 4A). Über zwei Elektroden, von welchen eine ins Zellbad (außerhalb der Zelle) reicht und die andere in der Pipette ist, können dann Ionenströme aufgenommen werden, die im Bereich von ein-milliardstel (nano) Ampere liegen.

Abb 4: A) Patch-Clamp Konfiguration zur Messung von Ionenströmen über Kanäle in der gesamten Zelle. Das Innere einer Pipette (Glaselektrode) ist sehr dicht mit dem Zellinneren verbunden. Somit können Ionenströme detektiert werden. B) Kalzium-Stromverlaufskurve von Zellen die TRPV6 enthalten in Abhängigkeit von CaM-Konzentrationen in der Zelle.

Überdies ermöglichte die konfokale Fluoreszenzmikroskopie die Detektion einer Interaktion zweier Proteine (in diesem Fall des TRPV6 Ionenkanals mit dem CaM). Zur Sichtbarmachung sind beide Proteine mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Wenn der Abstand dieser Farbstoffe, die jeweils an den Proteinen hängen, kleiner als 10 nm ist, kann bei Anregung eines der Farbstoffe auch das zweite zum Fluoreszieren gebracht werden. An der Stelle in der Zelle, wo so etwas detektiert werden kann, liegt eine Interaktion beider Proteine vor.

Abb 5: A) Änderung des FRET (Interaktionssignals) der zwei unterschiedlich Farbstoff-markierten Proteine TRPV6 und CaM in Gegenwart und Abwesenheit von Ca2+. B) Bereiche der Zelle in denen eine Interaktion der beiden Proteine stattfindet sind ganz rechts hellblau bis gelb dargestellt.

Somit gelang es an einer lebenden Zelle zu zeigen, dass CaM für den Inaktivierungsprozess von TRPV6 essentiell ist (Abb 4B), da es bei Kalzium-Anstieg in den Zellen an diesen Ionenkanal bindet (Abb 5B), wodurch er geschlossen wird.

Abb 6: Mechanismus der TRPV6 Regulation durch CaM. Ist der Ca2+-Spiegel in der Zelle niedrig, ist CaM (grün) nicht an den TRPV6 (blau-braun-oranger Komplex) gebunden. Strömt Ca2+ ein (schwarzer Pfeil), bindet Ca2+ an CaM und führt zu einer Bindung des Ca2+/CaM Komplexes an den TRPV6. Dadurch wird der Ionenkanal geschlossen und es kann kein weiteres Kalzium mehr in die Zell einströmen (rotes Kreuz).

Somit wird der Einstrom von weiterem Kalzium gestoppt (Abb 6). Dieser blockierende Effekt von CaM am Kalziumstrom könnte eine Möglichkeit sein einem weiteren Krebswachstum entgegenzuwirken.

Zusammenfassend ist festzuhalten, dass hiermit ein wichtiger Regulationsmechanismus für einen TRP Kanal aufgeklärt wurde, der nun im Hinblick auf einen neuen therapeutischen Ansatz zur Behandlung von Prostatakrebs weitreichende Bedeutung hat.

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1) Das sogenannte TRPV6-Protein wurde ursprünglich im Sehsystem der Fruchtfliege Drosophila entdeckt und hinsichtlich seines Verhaltens bei Lichteinfall charakterisiert. Eine Mutation der Proteine führt zum Erblinden der Fliegen. Molekular betrachtet entsteht eine vorübergehende Veränderung der Ladung der Zelle, daher der Name "Transient Receptor Potential" (TRP).<