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Markus Axmann - Dem Verkehrschaos in unseren Zellen auf der Spur

Hochsensitive Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung zellulärer Transportprozesse in drei Dimensionen

oder

Dem Verkehrschaos in unseren Zellen auf der Spur


Markus Axmann
angefertigt am Institut für Biophysik

Kurzfassung PDF

Vortrag PPT

Leben ist Bewegung (Martin Buber, 1878-1965) –
Dieses geflügelte Wort ist auch in der mikroskopischen Welt der biologischen Zellen von grundlegender Bedeutung. Um ihre verschiedenen Funktionen ausüben zu können, besitzen Zellen einen komplex strukturierten Aufbau. Gezielter Transport zwischen diesen Strukturen ist überlebenswichtig – viele Krankheiten fußen auf Störungen im logistischen Wechselspiel von zellulären „Lieferanten“, „Frächtern“ und „Empfängern“. Die meisten Zellen sind kaum größer als ein Hundertstel Millimeter – also damit noch deutlich kleiner als der Durchmesser eines menschlichen Haares. Für die Beobachtung der noch zehntausendmal kleineren biologischen Bauteile – einzelne Proteine, Lipide oder andere essentielle Biomoleküle – ist somit eine überaus empfindliche Messmethode notwendig. Mit einer am Institut für Biophysik entwickelten, nun verfeinerten Methode zur Mikroskopie ist es gelungen zwei dieser Transportmechanismen – stellvertretend für unzählige andere – dreidimensional zu untersuchen.

Biomoleküle werden häufig für den Transport in größeren Strukturen – sogenannten Vesikeln – geeignet verpackt. Die Bewegung solcher Vesikel innerhalb von Nervenzellen über ein „Schnellstrassen-System“ konnte damit im Detail beobachtet und beschrieben werden. Eine besondere Herausforderung stellte die Erfassung der Bewegung einzelner Proteine innerhalb der Zellmembran – der äußeren Hülle einer Zelle – dar. Erst die dreidimensionale Erfassung und die hohe Präzision in der örtlichen und zeitlichen Bestimmung der einzelnen Abläufe ermöglichten neue Einblicke auf diese hochdynamische Prozesse.

Abb. 1 Schema des experimentellen Aufbaus und Meßprinzip

      
      
      
      
      
Das Messprinzip der Dreidimensionalität beruht auf der Tatsache, dass das von einer Lichtquelle emittierten Signals umso breiter erscheint, je weiter die Beobachtungsebene von der tatsächlichen Position der Lichtquelle entfernt ist. Vermisst man in mehreren Ebenen die Signalbreite, lässt sich so auf die Position parallel zur optischen Achse rückschließen. Die Position in der Beobachtungsebene (senkrecht zur optischen Achse) erhält man durch Einpassen der theoretisch zu erwartenden Intensitätsverteilung (Gaußfunktion) an das Messsignal. Die Methode erlaubt es im konkreten Fall alle 455 ms die Position eines Objekts dreidimensional zu bestimmen.
Zwei Laser dienen als Lichtquelle zur Anregung spezifischer Fluorophore (=fluoreszierende Moleküle); der optisches Aufbau erlaubt durch ein System von Blenden die Modulation der Lichtpulse. Mit Hilfe eines elektronisch gesteuerten Piezo´s ist es möglich das Objektiv und damit die erwähnte Beobachtungsebene gezielt durch das zu untersuchende Objekt zu bewegen.
Um die Bewegung verfolgen zu können, ist es nötig die zu untersuchenden Objekte spezifisch zu markieren. Beim Vesikeltransport wurde das natürlich vorhandene, in der Vesikelmembran gelegene Protein Synaptobrevin durch genetische Techniken mit dem Fluorophor eGFP verbunden. Dieser Flurophor kann mit dem Ar-Ionen-Laser (siehe Abb. 1) angeregt werden.

Abb. 2 Markierung des Vesikelmembranproteins Synaptobrevin mit dem Fluorophor eGFP

Eine spezifische Markierung des Kaliumkanals Kv1.3 - eines Zellmembranproteines - gelingt mit einem Bestandteil des Skorpiongiftes namens Hongotoxin, welches chemisch wiederum mit dem Fluorophor Cy5 verbunden wurde. Dieser kann mit einem Farbstofflaser anreget werden.

Abb. 3 Markierung des Kaliumkanals Kv1.3 mit dem Fluorophor Cy5 über das Skorpiongift Hongotoxin

Aus den Trajektorien einzelner Kaliumkanäle sowie einzelner Vesikel lassen sich bewegungsspezifische Parameter wie Geschwindigkeiten, Orientierungen, Verweildauern, Diffusionskonstanten etc. gewinnen.