Page Areas:



Additional Information:

News

DK Nanocell

Logo DK Nanocell

We are taking part in the interdisciplinary graduate college called "Nanocell", with the project "Modelling of conformational transitions of fluorescent labelled proteins". ...  more of DK Nanocell (Titel)

Location Physics-Building

Location Physics-Building

Maps and directions to JKU. ...  more of Location Physics-Building (Titel)

LEO German-English Dictionary


Position Indication:

Content

Daniel Bergmair - ... kommt irgendwo ein Lichtlein her!

Photoaktivierte Lokalisierungs-Mikroskoplie (PALM) an Orai1-Kanälen

oder

... kommt irgendwo ein Lichtlein her!

Daniel Bergmair
angefertigt am Institut fuer Biophysik

Kurzfassung PDF

Vortrag PPT

Vortrag ZIP

Video Sequence AVI 14MB

Video "bewegter Gauss" AVI 1MB

Video "Jede Zelle.." AVI 9MB

Hinter dem Namen PALM verbirgt sich eine ausgeklügelte Mikroskopie-Methode, die es erlaubt, die Grenzen der klassischen Lichtmikroskopie zu überwinden. Seit der Erfindung des Mikroskops wurde die Bildgebung immer ausgereifter. Doch es gab für die Auflösung ein natürliches Limit, das eng mit der Wellenlänge des Lichtes zusammenhängt. So gelangte man irgendwann an die Grenze von ca. 200 Nanometern (1 Nanometer = ein Millionstel Millimeter), die 2 Objekte voneinander entfernt sein müssen, um noch getrennt wahrnehmbar zu sein.

Abb. 1: Zwei Signale, die weit genug voneinander entfernt sind um separiert wahrgenommen werden zu können

Abb. 2: Die zwei Signale kommen sich näher, sind jedoch noch getrennt wahrnehmbar

Abb. 3: Sind zwei Signale näher als ca. 200nm zusammen, so können sie nicht mehr individuell wahrgenommen werden.

Allerdings gibt es viele interessante molekular-biologische Prozesse, die sich unterhalb dieses so genannten Beugungslimits abspielen. So wird bei einem gewissen Ionen-Kanal in der Zelle von Anhäufungen berichtet, bei denen die einzelnen Moleküle nur um die 30nm voneinander entfernt sind. Deren Struktur bleibt jedoch für herkömmliche Mikroskopie verborgen.

Abb. 4: Orai1 Kanäle (grün), die mit Kanälen im Endoplamatischen Reticulum (ER) Cluster formen, um den Kalzium (rot) Einstrom einzuleiten. Die Distanz der Einzelnen Orai1-Kanälen zueinander beträgt etwa 30nm.

Um diesen Kanal namens „Orai1“ und dessen Verteilung erforschen zu können, war es meine Aufgabe in der Diplomarbeit die neuartige Mikroskopie-Methode PALM bei einem vorhandenen Mikroskop umzusetzen.

Der Trick bei PALM ist, dass man Farbstoffe genetisch an die Kanäle hängt, die durch einen Laser in einen hellen und in einen dunklen Zustand geschaltet werden können.









Abb. 5: An die Untereinheiten des Orai1 Kanals wurden photaktivierbare Farbstoffe genetisch angehängt.

Abb. 6: Das photoaktivierbare GFP. Zuerst ist es dunkel, wird es jedoch mit einem Laser aktiviert so beginnt es zu fluoreszieren.

Abb. 7: Eine Zelle vor (oben) und nach (unten) der Aktivierung. Die Farbskalierung gibt die Anzahl der detektierten Lichtteilchen an.

Wenn nun ein einzelnes Signal genügend weit von einem anderen entfernt ist, so ist es möglich, dieses mit Hilfe von mathematischen Funktionen zu beschreiben und daraus dann die genaue Position des Moleküls mit nur ~40nm Ungenauigkeit zu bestimmen.

Abb. 8: Ein einzelnes Signal kann mathematisch mit einer Funktion beschrieben werden, die es erlaubt, dessen Position mit Nanometer-Genauigkeit zu beschreiben.

Schaltet man also nacheinander die Farbstoffe der verschiedenen Kanäle an, bestimmt deren Position, und schaltet sie dann wieder aus, kann man schrittweise alle Kanäle in der Zelle lokalisieren und bekommt so ein Bild mit einer Auflösung, die wesentlich besser ist als die bisherige Grenze des Beugungslimits.




Abb. 9: Zyklus um zu einem Super-resolution Bild einer Zelle zu kommen.

Abb. 10: Das PALM Bild einer Zelle (weiß). Man sieht die Orai1 Kanäle in Grün und die Kanäle im ER mit denen sie clustern in Rot. (das eingefügte Quadrat misst ca. 20x20 µm²).

Auf diese Weise entstand an der Linzer Uni das erste Super-resolution Bild einer Zelle, das die Verteilung dieses Orai1-Kanals zeigt.