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Karin Hohenthanner - Diplomarbeit


Regulationsmechanismen von nativen und exprimierten L- Typ Ca2+-Kanälen


Karin Hohenthanner

angefertigt am Instituts für Biophysik

Die rhythmische Kontraktion des Herzens gewährleistet die Aufrechterhaltung des Blutkreislaufs und wird durch den Einstrom von Ca2+-Ionen durch sogenannte L-Typ Ca2+-Kanäle in die Herzmuskelzelle vermittelt.
Damit ist die Charakterisierung des L-Typ Ca2+-Kanals auch für die Kardiologie von großer Bedeutung.
Ca2+-Kanäle durchspannen die Zellmembran und bilden selektive Poren, die in Abhängigkeit vom Phosphorylierungszustand und der Membranspannung Ca2+-Ionen in die Zelle einströmen lassen.
Strukturell betrachtet besteht der L-Typ Ca2+-Kanal aus drei zusammengelagerten Proteinen, der α1-β- und α2-δ-Untereinheit, wobei die α1-Untereinheit die Pore bildet.

Mit hilfe der Patch Clamp Technik kann der Ionenstrom durch einzelne Kanäle gemessen und das Schaltverhalten in Abhängigkeit obiger Bedingungen studiert werden. Hier wird eine Pipette auf die Zellmembran aufgesetzt und eine kleine Membranfläche ("patch") untersucht. Diese Versuchsanordnung ("cell attached") erlaubt die Messung von Ca2+-Strömen durch einzelne Kanäle innerhalb des Membranstücks.
Wird die Pipette von der Zelle abgelöst, bleibt das Membranstück an der Pipette haften, und die Innenseite wird dadurch von außen frei zugänglich ("inside out"). In dieser Anordnung beobachtet man zuerst eine Abnahme der Kanalaktivität, dann das Verschwinden der Kanalöffnungen ("run down"). Daraus schließt man, daß cytosolische Faktoren für die Funktionalität des Ca2+-Kanals mitverantwortlich sind.

Dazu gehört Calpastatin. Messungen von Ca2+-Kanalströmen sind also selbst in der "inside out" Anordnung möglich, wenn Calpastatin und ATP (ATP für Phosphorylierungsreaktionen) an der Innenseite des Membranstücks vorhanden sind. Calpastatin funktioniert als Hemmer der Protease Calpain, doch diese Funktion ist nicht für die Aufrechterhaltung der Kanalaktivität verantwortlich, da synthetische Calpainhemmer diesbezüglich unwirksam sind.

Wird der Kraftstoff der Zelle, ATP, gegen ähnliche Substanzen ausgetauscht, die für eine Phosphorylierungsreaktion verwendet werden können, verringert sich die Kanalaktivität in der inside-out Anordnung, wobei der Kanal zwar verfügbar bleibt, die Wahrscheinlichkeit für eine Öffnung aber dementsprechend sinkt. Zum gleichen quantitativen Ergebnis gelangt man, wenn anstatt des gesamten Kanalproteins nur die eigentliche Pore (α1-Untereinheit) zur Messung verwendet wird. Dies kann molekularbiologisch mittels Expression einzelner Untereinheiten
des Ca2+-Kanals bewerkstelligt werden.

Messungen am α1+β-Untereinheitenkomplex liefern Werte für Verfügbarkeit und Öffnungswahrscheinlichkeit, die mit dem nativen Ca2+-Kanal am Herzen vergleichbar sind. Die beiden Systeme α1 und α1+β-Untereinheit unterscheiden sich auch in der Ca2+-induzierten Inaktivierung.
Dies ist ein negativer Feedback-Mechanismus bei dem das einströende Ca2+ das Schließen des Kanals fördert, um damit einen zu hohen Ca2+-Spiegel in der Zelle zu verhindern.
Hier reagiert die α1-Untereinheit insensitiver auf die Ca2+-Konzentration, d.h. die Inaktivierung der α1-Untereinheit erfolgt erst bei deutlich höheren Ca2+-Konzentrationen.

Neben der Verwendung von exprimierten Kanaluntereinheiten bietet die Molekularbiologie die Möglichkeit kleine Bereiche innerhalb eines Kanalproteins zu verändern. Damit ist es möglich, gewissen Bereichen im Kanal spezielle Funktionen zuzuordnen, was für die Entwicklung sehr spezifischer Pharmaka von großem Interesse ist.